技術服務 哺乳動物細胞雙雜交服務

艾柏森（北京）生物科技有限公司

酵母雙雜交檢測實驗技術服務

　　隨著分子生物學研究尤其是人類基因組計劃的迅速發展，為適應對眾多基因或蛋白進行功能研究的發展趨勢，已出現了很多新技術。其中酵母雙雜交技術以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質之間在活細胞內的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應用。

　　蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的實驗，同以往研究蛋白質-蛋白質之間相互作用的實驗手段相比，酵母雙雜交系統具有其*優勢。

1、融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內進行，蛋白質保持天然的折疊狀態，這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的，它所證實的蛋白質間相互作用將更接近于體內的真實水平。
2、雙雜交系統的敏感度非常高，蛋白質之間結合常數低至1mmol/L時都可以被偵測。
3、在篩選cDNA 文庫時，雙雜交系統能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列，它只需構建質粒而不必準備抗體或純化蛋白，省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

酵母雙雜交實驗原理：

　　以Gal4系統為例，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結構域(1-147aa與768-881aa)構成。在利用GAL4系統篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結合結構域與靶蛋白即"誘餌"相結合，轉錄活化結構域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GAL UAS）結合但不能引起轉錄，單獨的AD則不能與GAL UAS結合；只有當BD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GAL UAS結合并且引起報道基因的轉錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。

★ 酵母單/雙雜交檢測服務項目列表

服務一、酵母單雜交文庫構建服務

　　酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結合的蛋白質，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。為了獲得良好的酵母單雜交篩選實驗結果，構建酵母單雜的文庫至關重要，我們可以依據不同的實驗需要及物種特性，選擇不同的體系建庫方法，我們的技術專家可以熟練的應用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立，同時，我們的技術專家也開發出了基于同源重組原理的建庫方法。

★ 酵母單雜交文庫構建實驗流程： 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA連接接頭 
 5. cDNA按長度分離 
 6. cDNA與酵母單雜交文庫載體pGADT7進行all-direct重組 
 7. 重組產物電轉化 
 8. 文庫檢測以及質粒提取

★ 酵母單雜交文庫構建實驗材料要求： 

客戶構建的酵母單雜交cDNA文庫，由客戶提供組織、細胞或總RNA給我們即可：

細胞樣本：細胞數量大于1*10^7；

動物樣本：大于1g；

植物樣本：大于2g；

總RNA：大于200ug。