什么是抗體片段和抗體片段化

抗體片段化，就是用工具（蛋白酶及化學物質）將抗體分子切成特定大小的片段。Why？因為在實際運用時，抗體分子真的太大了！抗體分子的分子量一般為幾百道爾頓（例如IgM五聚體就更龐大了），分子直徑在10 nm~15 nm之間，而制備成抗體片段后，就呈現出各自的優勢。

                                          各類型抗體及抗體片段的分子量

抗體片段特性及功能
抗體片段化后，因去掉了某些功能結構域以及分子量的改變，具有與全長抗體不同的特性：
1、顯著降低Fc的非特異性結合；
2、沉淀和免疫印跡中可降低抗體與proteinA、proteinG的結合；
3、更好的組織滲透性，免疫組化實驗中染色效果更優異；
4、避免全長抗體的空間位阻效應，在固相抗原檢測中靈敏度更高；
5、在抗原-抗體結合研究中可避免Fc相關作用因子的干擾；
6、X-射線晶體學或核磁共振研究免疫識別的結構基礎時系統更加簡化；
7、體內實驗時相對全長抗體具有更低的免疫原性；
8、能偶聯或結合酶、毒素、藥物及放射性核素等。
抗體片段的這些優勢可使其很好地應用于免疫化學技術、臨床診斷及治療等領域。

                                              IgG、IgM各結構域功能及各片段的特性    

IgG片段化工具
木瓜蛋白酶Papain
來源于女生*的水果—番木瓜，非特異性的巰基蛋白內切酶，分子量23 kDa，它在還原劑的存在下能將IgG切割成三個片段：2個Fab片段和1個Fc片段，最適反應pH6.5。木瓜蛋白酶最初是被用于制備Fab片段，不過它也可以用來制備F(ab')2片段，但是需要將其先用半胱氨酸活化，然后*去掉半胱氨酸再和IgG共同孵育。但是得到的F(ab')2片段并不均一，而且如果有半胱氨酸存在很容易過度切割。
胃蛋白酶Pepsin
由胃粘膜主細胞（gastric chief cell）分泌，非特異性的巰基蛋白內切酶，分子量35 kDa，它能將IgG切割成1個F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’，可通過透析等方法除去），在中性及堿性環境下會不可逆失活，最適反應pH1.0。F(ab')2片段在溫和的還原劑（如2-Mercaptoethylamine•HCl，2-MEA）作用下可得到2個單價的含巰基的Fab‘片段，這些片段因為自帶巰基可以用來偶聯檢測標記物而不影響片段的結合活性，當然也可以用N-Ethylmaleimide (NEM)將巰基保護起來防止再次形成F(ab')2。
無花果蛋白酶
來源于無花果樹的膠乳和不成熟的果實乳汁，非特異性的巰基蛋白酶，分子量26 kDa，它能在4 mM半胱氨酸的環境下將IgG切割成1個F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’），或者在25 mM半胱氨酸的環境下將IgG切割成2個Fab片段加Fc的多肽碎片（Fc’），最適反應pH6.4。無花果蛋白酶水解IgG得到的F(ab')2片段大小與胃蛋白酶水解IgG得到的非常接近，而其免疫活性和親和力則與全長IgG1抗體別無二致，在制備鼠類IgG1的片段時無花果蛋白酶是很好的選擇。

                                                                     IgG的片段化   

IgM片段化工具
       不同種屬的IgM片段化產物是有差異的，如鼠和人IgM在單體的連接方式上的不同導致二硫鍵位置的不同使得產物有差異，另外不同物種IgM上寡聚糖修飾的差異也會影響酶的切割，所以不同種屬的IgM進行片段化需要不同的條件，沒有一套通用的方案。
胃蛋白酶Pepsin：可將IgM切割成F(ab')2、Fab和Fv片段。
胰蛋白酶Trypsin：絲氨酸蛋白酶，最適反應pH8.0。可將IgM切割成F(ab')2、Fab、IgG型和Fc5片段。
化學試劑：2-MEA可將IgM處理成"IgG"型片段或/和還原型IgG ("rIgG"）片段。對小鼠IgM控制還原條件可以產生反轉的"IgG"型片段

                                              IgM的片段化