噬菌體展示系列之抗體親和力成熟

近年來，隨著抗體藥物的廣泛上市，抗體已經取代基因治療成為生物制藥領域的主要生力軍。而抗體在疾病診斷、治療和預防方面的作用很大程度上取決于其親和力的高低，隨著抗體工程技術的不斷發展，如何提高抗體親和力已成為抗體工程的難題之一。圍繞這一問題人們已經從不同的角度展開了研究，例如，提高抗體庫的質量、增加抗體庫的多樣性、進行抗體重鏈或輕鏈的替換以及點突變有目的進行氨基酸替換等都能不同程度地提高抗體親和力。

抗體親和力表示抗體與抗原結合能力的大小?？贵w親和力成熟是指機體正常存在的一種免疫功能狀態。在體液免疫中,再次應答所產生抗體的平均親和力高于初次免疫應答，這種現象稱為抗體親和力成熟。

噬菌體展示技術作為一種*的抗體庫構建技術能結合多種技術手段，于體外實現抗體的親和成熟，并配合親和篩選方法獲得具有高親和力的抗體。在噬菌體抗體展示技術中，VH和VL基因的隨機重組，在一定程度上模擬了體內抗體親和力成熟的過程。如果結合其它技術則可以使抗體的親和力提高到一個更高的層次，下面介紹一些抗體親和力成熟的方法。

體外抗體親和力成熟的幾種策略
要想實現抗體的親和力體外成熟，就必須充分地了解天然抗體的親和力體內成熟原理，設計模擬體內可能出現和存在的變化，從而促進抗體的體外進化。天然抗體的親和力成熟可以分為體細胞高頻突變和克隆選擇兩個過程。在天然抗體親和力成熟的過程中，抗原刺激下的體細胞高頻突變有著舉足輕重的作用，因此親和力體外成熟的策略也多在抗體基因突變水平上，即采用各種突變方法來模擬體內的高頻突變。

1.隨機突變

(1)錯配PCR
通過改變PCR反應條件，提高核酸錯配率將隨機突變引入基因序列。該技術可以通過提高鎂離子濃度、加入錳離子、失衡4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs) 濃度、使用低保真DNA聚合酶等方法，來提高抗體基因的突變率。除此之外，突變率的高低也可以采用改變模板DNA的復制次數進行控制。復制次數越多，突變率將累積得越高。理論上經過多輪的PCR反應可獲得0.15%~3%的突變頻率，再用突變的抗體基因庫建立噬菌體抗體庫，最后從中篩選高親和力抗體。噬菌體展示技術有效的改善了使用錯配PCR技術導致的抗體親和性和特異性的喪失，以及有效突變體過少的問題。
(2) DNA改組
DNA改組技術是對同源的抗體基因,采用脫氧核糖核酸酶I將其切割成不超過50bp的.片段，再隨機組合后進行PCR擴增成完整的抗體基因。它包含了抗體片段隨機化切割、重組和篩選的過程，一定程度上模擬了天然抗體的親和力成熟過程，并加快了體外定向進化速度。采用連續多輪的DNA改組具有去除有害突變優勢。另外，DNA改組獲得的突變體，突變位點可以位于非抗原直接接觸的區域，有擴大庫容的作用。

(3)鏈改組.
鏈改組即鏈替換技術，是固定抗體的一條輕鏈或重鏈不變，而將另一條重鏈或輕鏈經過突變處理后，重新與固定鏈配對，以提高抗體親和力的方法。該方法保留一 條鏈不變，目的是為了保持抗體的特異性，而將經過突變處理的另一條鏈與其配對，是為了增加抗體的親和力，以篩選到更高親和力的抗體,重復進行鏈替換和親和力篩選將產生更高親和力的抗體。

將噬菌體展示技術與此技術結合構建次級抗體庫將使該法更便利。鏈改組技術能有效提高抗體親和力，但如果無法明確了解zhiding抗原的基因結構，或者抗體基因片段未能擁有一 個比較完整的初級抗體庫，則不適合使用鏈改組技術。

(4)突變株
EscherichiacoliMutD5是zui常用的大腸埃希菌突變株，該菌株可以校對和復制后錯配修復缺陷，產生高頻率的單個堿基替換，突變率高于普通菌株105 倍。突變株法的優勢是突變發生在轉化宿主菌后，而其他方法的突變均發生于轉化之前，而轉化效率是限制大容量突變庫構建的關鍵因素之一。使用突變株法可以構建庫容為1012_ 104 個克隆的超大容量抗體庫，利用噬菌體展示技術篩選高親和抗體,通過該法的可以獲得一些未能在定向突變中獲得的突

艾柏森生物提供抗體親和力檢測服務如下

非標記(Label-free) 交互分析是科學家用于研究生物分子之間相互作用的重要方法，艾柏森生物研究團隊可運用*的Biacore、ProteOn和octet系統對抗體的親和力和動力學進行測量。 這些系統主要基于光學效應的技術-表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)和生物膜層表面干涉技術(bio- layer interferometry, BLI)，可直接檢測分子間相互作用并進行實時監測。親和力動態測定方法表面等離子共振法(SPR) 是一種生物大分子相互作用分析(biomolecularinteraction analysis, BIA)技術，這種技術基于表面等離子共振的物理光學現象的生物傳感分析技術,不必使用熒光標記或同位素標記，從而讓保持了生物分子的天然活性，且可實時檢測抗原抗體等生物大分子相互作用的全過程。

SPR光譜可以實時監測傳感芯片表面液相折射率的變化，而這一變化和傳感芯片 表面所結合的生物分子的質量成正比，共振單位(Response unit, RU)相對時間來表示。因此，通過分析反應過程中各時刻的SPR光譜，可在非標記的情況下監測生物分子間的相互作用。
SPR技術特點:
●Lable-Free技術， 無需利熒光素同位素等分子檢測
Real-Time技術，可直接、實時監測相互作用的全過程
●獲得分子相互作用的親和力及熱動力學信息
●光路不經過樣品，不受樣品顏色影響
●樣品消耗低，自動化程度高
結果交付:
●和力報告(定量分析) :結合常數(Ka) 、解離常數(Kd)和親和常數(Kp)
●電好圖片&完整實驗報告,包括實驗步驟、使用試劑、儀器、軟件檢索參數等