單克隆抗體藥物生產中細胞培養對抗體糖基化的影響

1986年，世界shouge單克隆抗體藥物——抗CD3單抗OKT3獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的上市批準，單克隆抗體藥物產業化從此拉開序幕。作為主要應用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領域的抗體類藥物，目前，全球已經批準的單克隆抗體藥物超過了80個，年銷售額增長率超過30%，單克隆抗體在生物制藥領域發展得越來越快。隨著抗體工程的發展，嵌合單克隆抗體以及人源化單克隆抗體相繼問世，而以B淋巴細胞cDNA庫和噬菌體展示技術的發展使全人源單克隆抗體成為可能，第一支全人源單克隆抗體——阿達木單抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批準上市。全人源單克隆抗體具有良好的功效，且無fu作用，已成為當前發展最迅速的一類單克隆抗體藥物。

單克隆抗體是蛋白類大分子，具有復雜的結構特征，主要由Fab和Fc兩大功能區組成，在Fab段和Fc段特定的位點存在糖基化修飾。糖基化修飾形成的糖鏈僅僅占整個單克隆抗體的3%，盡管比例不高，但糖鏈結構卻發揮著極其重要的作用：能夠維持抗體的空間構象、穩定抗體的結構，研究表明抗體脫糖基化后對熱的穩定性大大降低；糖鏈結構還能保護抗體不受某些蛋白酶水解；糖鏈中特別的糖型還與免疫效應功能密切相關，糖型并非在人體內生物合成，因此可能具有一定的免疫原性，可加速單抗的血漿清除。總的來說，糖基化修飾不僅對維持單克隆抗體的結構有重要作用，同時一些特定的糖基化修飾類型以及不同的糖基化修飾程度均會影響抗體的安全性特征，而且，糖基化修飾也影響藥物的有效性。

單克隆抗體藥物的糖基化具有高度的異質性，在單克隆抗體的糖基化中，由于糖基化種類的多樣性以及連接方式的多樣性，因而形成了自然界中最復雜和最多樣化的蛋白結構。單克隆抗體藥物的糖基化結構對于藥物的療效和安全具有重要意義。

圖1：IgG的結構示意圖

有趣的是，盡管單克隆抗體藥物的輕鏈和重鏈的氨基酸序列是對稱的，但是Fc片段上N端糖基化修飾并非全部都為對稱。單抗藥物的N端糖基化修飾通常是復雜的雙天線糖鏈結構，可能發生巖藻糖化和唾液酸化。通過表1，也可以看到單克隆抗體藥物常見糖基化修飾對抗體藥物結構和功能有著很大的的影響。

表1：抗體藥物常見糖基化修飾及其對抗體藥物結構和功能的影響

研究發現糖鏈中不同末端糖基化對IgG功能有不同的影響，IgG因不同的連接方式存在3種不同類型的N端糖型，分別為高甘露糖型、甘露糖雜合型、甘露糖復雜型，大多數的雜合型和復雜型存在核心巖藻糖基化，少數沒有。

圖2 3種不同類型的N端糖型

所以說單克隆抗體藥物糖基化對于其療效及生產就顯得極為重要，各大生產商都非常重視單克隆抗體藥物糖基化的質量監控。在抗體藥物生產過程中shouxuan哺乳動物細胞表達系統，在哺乳動物細胞表達系統中因其具有天然蛋白的加工機制，當然也包括了抗體蛋白的糖基化修飾，這樣所生產出來的單克隆藥物就與天然的蛋白十分接近，并且保證了治療效果。單克隆藥物的糖基化修飾主要是由寡糖連接到天冬酰胺的側鏈，即N-連接，或者連接到絲氨酸/蘇氨酸連接，即O-連接，如上文中提到的連接形式及種類。N端或者O端的多糖會影響單克隆抗體藥物的蛋白活性，同時也決定了此種單克隆抗體藥物在體內的半衰期。正是因為這些特點，抗體藥物的糖型及糖基化修飾備受藥品監管部門的重視，力求達到質量標準，以確保其有效性和安全性。

在細胞培養過程中，決定單克隆抗體糖基化的主要因素有細胞表達系統、培養模式、生產工藝、培養基等，這幾個方面都會改變抗體糖基化修飾，對單克隆抗體研究及生產等相關研究帶來了巨大挑戰。表2列舉了細胞培養過程中影響抗體蛋白糖基化的各種變量。 

表2 細胞培養過程中影響抗體蛋白糖基化的變量匯總

接下來我們將重點對細胞表達系統、培養模式、 生產工藝、 培養基等影響蛋白藥物糖基化的研究進行總結。

2.1 表達系統對抗體藥物糖基化修飾的影響

在抗體藥物研發階段，研究細胞表達系統對糖基化的影響十分關鍵。目前，商業化生產抗體藥物的細胞表達系統主要是CHO細胞，少部分使用SP2/0、人纖維肉瘤細胞、人類淋巴母細胞、小鼠骨髓瘤細胞等。有報道表明CHO懸浮細胞表達人β-干擾素與微載體貼壁CHO細胞表達的干擾素具有相同的糖型。由相同組織分離的細胞表達的功能性酶種類也是多樣化的，從而表達糖基化蛋白的能力也不同。CHO細胞中CHO-K1和 DUKX-B11都含有未激活的α(1,3)GalT基因，同樣都有低水平的NGNA，CHO細胞表達系統在生產抗體藥物時對糖基化修飾的影響是zui普遍的。

CHO細胞表達糖基化的機制同人類的IgG糖基化作用機制十分相似，僅有一些微小的不同之處。據報道，人的IgG末端唾液酸殘基以α-2,6連接，CHO細胞來源的抗體以α-2,3連接。無論是人的IgG，還是CHO細胞表達來源的抗體，末端唾液酸殘基的含量都很低。因此，唾液酸殘基連接的不同對產品的質量可能不會造成影響。而且，許多人類血清糖蛋白也含有α-2,3連接的唾液酸殘基。

因此可見，宿主細胞系極大地影響了單克隆抗體的糖基化修飾類型，進而影響單克隆抗體治療相關的安全性。對于生物制藥產業來說，選擇合適的宿主細胞系可以優化并控制糖基化修飾，進而提高產品的質量。

2.2 培養模式對抗體藥物糖基化修飾的影響

細胞培養方式常見的有三種：批次培養、分批補料培養、灌流培養。不同的細胞培養方式會明顯影響單克隆抗體藥物的糖基化修飾，在灌流培養模式下糖基化總體水平較分批補料培養模式下的唾液酸化有所增加。總體來說，連續灌流培養的糖基化程度較批次培養要高，而批次培養模式下的細胞增長速度快，灌流培養模式下細胞生長速度越慢糖基化程度越高。當然選擇哪一種培養方式取決于所生產的抗體藥物自身糖基化情況。