慢病毒載體構(gòu)建與包裝

慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

原理：慢病毒載體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。

包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。

實(shí)驗(yàn)流程：

1.        慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

2.        慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建

3.        慢病毒載體的包裝與濃縮純化