柱式質粒提取試劑盒

使用步驟

1、取 5-15 mL 過夜培養菌液加入離心管中，12000 pm 離心 1 min 收集菌體沉淀，盡量吸棄上清。

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入 500 uL Buffer P1 (已加入RNase A)，使用移液槍或旋振蕩器充分混勻，懸浮菌體沉淀，混勻至無菌塊。

3、向離心管中加入 500 uL Bufcr P2，溫和上下顛倒混勻 4-6 次，充分混勻使菌體裂解，此時溶液應變得清亮粘稠。

注意:溫和地混勻，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組 DNA。所用時間不應超過 5 min，以免質粒受到破壞

4、向離心管中加入 700 uL Bufer P3，立即溫和上下顛倒混勻 8-10 次，充分混勻，此時應

出現白色絮狀沉淀，12000 rpm 離心 10 min。注意: P3 加入后立即混合，避免產生局部沉淀。如果離心完仍有沉淀漂浮，可延長離心時間取上清。

5、將步驟 4 中的上清液分批轉移到已裝入收集管的吸附柱中，12000 rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。注意:一根吸附柱最大容積為 750 uL，請分兩次轉移上清液到吸附柱中。

6、向吸附柱中加入 500 uL Bufer PD，12000 rpm 離心 1 min，棄廢液。

7、向吸附柱中加入 600 uL Buffer PW (使用前請確認是否加入無水乙醇)，12000rpm 離心1 min，棄廢液。

注意:加入漂洗液 PW 后，室溫靜置 2-5 min，有助于更好的去除雜質。

8、重復一次步驟 7。

9、將吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm 離心 2 min，目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液。注意:乙醇殘留會抑制后續的酶反應，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數分鐘，確保乙醇揮發干凈。

10、將吸附柱放到一個干凈滅菌 1.5 L 離心管中，將吸附柱開蓋靜置數分鐘。向吸附膜中間位置懸空滴加 50-100 uL Buffer TE 或 ddHO (可提前放在 5565 C水浴鍋中預熱，提高質粒 DNA 回收率)，室溫放置 2 min。12,000 rpm ，離心 2 min 收集質粒 DNA 溶液(若需要獲得最高產量，建議將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復第 10 步進行二次洗脫。)。

11、質粒溶液保存在- 20C。