單克隆抗體制備的基礎(chǔ)知識，一篇搞定

　　單克隆抗體制備是基于B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生特異性抗體以及腫瘤細(xì)胞具有無限增殖特性這兩大關(guān)鍵生物學(xué)特性而發(fā)展起來的復(fù)雜但精巧的技術(shù)體系。其核心流程主要包含以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：
 

　　(一)免疫動物
 

　　選擇合適的抗原對特定的動物(如小鼠、大鼠等)進(jìn)行免疫接種。通常，抗原需要具備良好的免疫原性，能夠有效刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在多次免疫接種后，動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞會識別抗原并啟動體液免疫反應(yīng)，大量增殖分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。漿細(xì)胞能夠合成并分泌針對該抗原的特異性抗體，而記憶細(xì)胞則可在再次遇到相同抗原時(shí)迅速啟動免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體應(yīng)答。
 

　　(二)細(xì)胞融合
 

　　從經(jīng)過免疫的動物脾臟中分離出已致敏的B淋巴細(xì)胞，這些B淋巴細(xì)胞能夠分泌針對特定抗原的抗體，但它們在體外的培養(yǎng)條件下難以長期存活和大量增殖。與此同時(shí)，選取合適的骨髓瘤細(xì)胞，這類細(xì)胞具有在體外培養(yǎng)條件下可無限增殖的特性，但不能分泌特異性抗體。然后，通過特定的融合劑(如聚乙二醇，PEG)將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交瘤細(xì)胞既繼承了B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，又具備了骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性，從而能夠在體外持續(xù)培養(yǎng)并大量擴(kuò)增。
 

　　(三)篩選與克隆化培養(yǎng)
 

　　在細(xì)胞融合后，會得到多種類型的細(xì)胞混合體系，包括未融合的B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞以及雜交瘤細(xì)胞等。由于B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下不能長期存活或單獨(dú)增殖，所以需要通過特定的選擇性培養(yǎng)基來篩選出雜交瘤細(xì)胞。常用的培養(yǎng)基是HAT培養(yǎng)基，其中含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。在這種培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)而不能利用補(bǔ)救途徑合成核酸，會死亡；而未融合的B淋巴細(xì)胞本身不能在體外長期存活。只有雜交瘤細(xì)胞由于從B淋巴細(xì)胞處獲得了HGPRT基因，能夠在HAT培養(yǎng)基中存活并增殖。
 

　　篩選得到的雜交瘤細(xì)胞可能并非都是分泌所需特異性單克隆抗體的細(xì)胞克隆，因此需要進(jìn)一步進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。通過有限稀釋法等技術(shù)，將雜交瘤細(xì)胞稀釋到較低的密度，接種到多孔培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔內(nèi)理論上只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，單個(gè)細(xì)胞會增殖形成細(xì)胞克隆。然后，通過檢測各細(xì)胞克隆上清液中抗體的特異性和活性，篩選出能夠分泌所需單克隆抗體的陽性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，從而獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
 

　　(四)單克隆抗體制備方法
 

　　將篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，可以分為體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)兩種方法。體內(nèi)培養(yǎng)通常是將雜交瘤細(xì)胞接種到同源的動物腹腔內(nèi)，在動物體內(nèi)生長并產(chǎn)生腹水，腹水中含有高濃度的單克隆抗體，然后通過抽取腹水并經(jīng)過純化處理即可獲得單克隆抗體。體外培養(yǎng)則是在生物反應(yīng)器等適宜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，為雜交瘤細(xì)胞提供合適的營養(yǎng)物質(zhì)、氣體環(huán)境等條件，使其大量增殖并分泌單克隆抗體，再通過一系列的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，如鹽析、離子交換層析、親和層析等，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取和純化出高純度的單克隆抗體。